本发明公开了一种通过强化丙酮酸羧化途径促进α-酮戊二酸积累的方法，将来源于米根霉(Rhizopus oryzae)中编码丙酮酸羧化酶的基因RoPYC2过量表达于发酵法生产α-酮戊二酸的菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06中，获得了一株丙酮酸羧化酶活性提高的重组菌，其丙酮酸羧化酶活性提高了10.2倍(达到0.87U/mg protein)；以甘油为唯一碳源，发酵144h后，α-酮戊二酸产量达到47.2g/L，是出发菌株的1.3倍；丙酮酸产量降低到10.4g/L，是出发菌株的49.0％。本发明通过调控三羧酸循环的回补途径，成功实现了碳代谢流从丙酮酸节点流向α-酮戊二酸节点，在提高α-酮戊二酸产量的同时，减少了副产物-丙酮酸的生成。为今后利用代谢工程手段改造菌株促进目标产物过量积累提供了一定的借鉴意义。
1.一种应用酵母工程菌生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于采用酵母工程菌为出发菌株，接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于28℃、200rpm条件下培养20-24h；按10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，28℃，200rpm条件下培养144h；所述酵母工程菌过量表达外源丙酮酸羧化酶基因，构建方法为根据Genbank:HM130700.1，用化学全合成方法获得米根霉(Rhizopusxa0oryzae)丙酮酸羧化酶基因，克隆到表达载体后转化保藏编号为CCTCCNO：M207143的Y.lipolyticaWSH-Z06后得到所述酵母工程菌；1L种子培养基组成为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.5g，斜面用琼脂20g，pH5.5，自来水定容至1L；1L发酵培养基组成为：甘油100g，硫酸铵3g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁1.2g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.1g，盐酸硫胺0.2μg，在摇瓶时添加碳酸钙20g，自来水定容至1L。技术领域
本发明涉及一种高产α-酮戊二酸酵母工程菌，特别是一种通过代谢工程手段过量表达RoPYC2基因提高胞内丙酮酸羧化酶活性来强化三羧酸循环的回补途径，从而调控碳代谢流从丙酮酸进入三羧酸循环，实现α-酮戊二酸过量积累的酵母工程菌。
背景技术
α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，简称α-KG)是一种重要的有机酸，在食品、医药、化工和化妆品等行业都有广泛应用。作为三羧酸循环(TCA)的重要中间产物之一，α-酮戊二酸参与氨基酸、蛋白质、维生素合成以及能量代谢等重要过程，在微生物细胞碳氮代谢调控中起着重要的作用。目前，工业上生产α-酮戊二酸主要采用化学合成的方法，但是高污染、使用有毒和有害化学试剂等缺点限制了它的发展空间，而微生物发酵法正以高产量、高生产强度、环境友好等优点受到越来越多的关注。国内外关于微生物发酵法生产α-酮戊二酸的研究主要集中于对发酵条件的优化和控制，但是简单的发酵优化并不能很好地解决副产物积累的问题，代谢工程作为一种理性的菌种改造方法能够更加有效地实现目标产物的高产。虽然，目前采用代谢工程手段来强化α-酮戊二酸积累的研究鲜有报道，但是鉴于丙酮酸羧化途径在丙酮酸代谢和TCA循环中的重要作用，强化丙酮酸羧化途径应该是一条促进碳代谢流进入TCA循环的有效策略。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高产α-酮戊二酸酵母工程菌，其通过过量表达丙酮酸羧化酶基因，强化胞内丙酮酸代谢途径中的重要支路-丙酮酸羧化途径的代谢通量，实现α-酮戊二酸的过量积累。以下是本发明技术方案的详细描述。替换质粒上原有的标记基因赋予重组质粒对潮霉素B的抗性根据NCBI网站上hph基因序列(Genbank：K01193.1)，采用化学全合成方法，获得hph基因序列并克隆到质粒p0(Swennen，D.，M.F.Paul，L.Vernis，J.M.Beckerich，A.Fournier，andxa0C.Gaillardin.2002.Secretionxa0ofxa0activexa0anti-Rasxa0single-chainxa0Fvxa0antibodyxa0byxa0thexa0yeastsxa0Yarrowiaxa0lipolyticaxa0andxa0Kluyveromycesxa0lactis.Microbiol-Sgmxa0148：41-50)中，利用hph基因替换质粒p0上原有的URA3标记基因，赋予重组质粒p0(hph)对潮霉素B的抗性，便于后续重组菌的筛选。构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明质粒改造成功。目的基因RoPYC2扩增与表达质粒的构建根据NCBI网站上Genbank：HM130700.1，采用基因全合成方法获得丙酮酸羧化酶RoPYC2基因，克隆到p0(hph)，得到表达载体p0(hph)-RoPYC2。重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。过量表达RoPYC2的Y.lipolytica重组菌的筛选将重组质粒p0(hph)-RoPYC2经AvrII酶切、纯化后，醋酸锂法转化Y.lipolyticaxa0WSH-Z06感受态细胞。将能在YPD+HygB平板上生长的菌落，在YPD+HygB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子若干提基因组，利用引物RoPYC2-F和RoPYC2-R进行PCR验证，得到大约3.5kb的片段，表明RoPYC2基因已成功整合到Y.lipolyticaxa0WSH-Z06(保藏编号CCTCCxa0NO：M207143)基因组中。所得重组菌命名为Y.lipolytica-RoPYC2。该菌在以甘油为唯一碳源的培养基上生长时，丙酮酸羧化酶活性为0.87U/mgxa0protein，是出发菌株的10.2倍。微生物菌株的种子培养与发酵：种子培养基(g/L)：葡萄糖20g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.5g，琼脂20g(斜面用)，pH5.5，自来水定容至1L。发酵培养基(g/L)：甘油100g，硫酸铵3g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁1.2g，氯化钠0.5g/L，磷酸氢二钾0.1g，盐酸硫胺0.2μg，碳酸钙20g(摇瓶时添加)，自来水定容至1L。种子培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121℃，15min。维生素等热敏性材料配制后0.22μm膜过滤除菌，接种前加入。将实验菌株接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于28℃、200rpm条件下培养20-24h。按10％的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，28℃，200rpm条件下培养144h。细胞干重的测定：取一定量的菌悬液置于10mL容量瓶中，加2mL盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UVxa07500型可见分光光度计，于570nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。甘油、丙酮酸和α-酮戊二酸浓度的测定：高效液相色谱(HPLC)仪器：Agilentxa01100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)，色谱条件：色谱柱：Aminexxa0HPX-87Hxa0ionxa0exchangexa0column流动相：5mMxa0H₂SO₄流速：0.6mL/min柱温：35℃进样量：5μL紫外检测器波长：210nm(检测丙酮酸和α-酮戊二酸)示差折光检测器：检测甘油样品制备：500μL发酵液在10,000rpm下离心10min，取上清液移入1.5mL离心管中测甘油、丙酮酸和α-酮戊二酸的含量。取100μL上清液移入5mL容量瓶中，超纯水定容至刻度线，经0.45μm滤膜过滤，滤液供液相色谱分析。本发明的有益效果：本发明的特点是以一株能以甘油为唯一碳源，过量积累α-酮戊二酸的Y.lipolyticaxa0WSH-Z06为出发菌株，利用代谢工程手段构建了一株能过量表达RoPYC2基因的重组菌Y.lipolyticaxa0WSH-Z06-RoPYC2。通过强化丙酮酸羧化途径，加大碳代谢流进入TCA循环的通量，促进α-酮戊二酸的过量积累，同时减少副产物-丙酮酸的生成。在发酵144h后，α-酮戊二酸产量达到47.2g/L，是出发菌株的1.3倍。这一调节微生物细胞中TCA循环的回补途径，促进代谢流流向TCA循环中间代谢产物，实现代谢产物过量积累的策略，为工业生物技术特别是采用代谢工程手段改造菌株来提高目的产物的生成提供了新的技术思路。
具体实施方式
实施例1替换质粒上原有的标记基因赋予重组质粒对潮霉素B的抗性根据NCBI网站上hph基因序列(Genbank：K01193.1)，采用化学全合成方法，获得hph基因序列并克隆到载体质粒p0中，利用hph基因替换质粒p0上原有的URA3标记基因，得到重组质粒p0(hph)。重组质粒转化大肠杆菌JM109，挑取能在Amp平板上生长的菌落，以hph-F和hph-R为引物进行菌落PCR鉴定，得到大小约为1.6kb的条带。菌落PCR验证正确的转化子提取质粒，送上海生工进行测序，测序结果与预期一致，表明质粒改造成功。质粒经AvrII酶切，胶回收酶切片段，得到可用于转化的整合片段，醋酸锂法转化Y.lipolyticaxa0WSH-Z06感受态细胞。将能在YPD+HygB平板上生长的菌落，提取全基因组作为模板，hph-F和hph-R为引物PCR扩增得到约1.6kb大小的片段，表明含有hph基因的片段已成功整合到Y.lipolyticaxa0WSH-Z06基因组上，重组菌命名为Y.lipolytica-CON，作为后续发酵性能验证中的对照菌株。将重组菌Y.lipolytica-CON涂布YPD+HygB平板，28℃静置培养至长出单菌落。挑取500个单菌落分别点种于YPD和YPD+HygB平板上。根据YPD和YPD+HygB平板上菌体的生长情况进行重组质粒的稳定性验证。结果显示所有接种于YPD和YPD+HygB平板上的菌都长出了单菌落，表明重组质粒具有良好的稳定性，可用于外源基因的表达。其中：YPD培养基(g/L)葡萄糖20g，Tryptonexa020g，Yeastxa0extractxa010g，固体培养基添加20g琼脂。YPD+HygB抗性平板(g/L)YPD+200mg潮霉素B，固体培养基添加20g琼脂。实施例2重组菌Y.lipolytica-RoPYC2的构建及鉴定根据NCBI网站上RoPYC2基因序列(Genbank：HM130700.1)，采用化学全合成方法，得到RoPYC2目的片段(大小约为3.5kb)。利用酶切连接技术将RoPYC2基因与经SfiI和NotI酶切后的质粒p0(hph)连接，得到RoPYC2基因表达载体p0(hph)-RoPYC2。构建好的重组质粒经酶切分析，并进行DNA测序。基因测序结果与预期一致，表明重组质粒构建正确。将重组质粒p0(hph)-RoPYC2经AvrII酶切、纯化后，醋酸锂法转化Y.lipolyticaxa0WSH-Z06感受态细胞。将能在YPD+HygB平板上生长的菌落，在YPD+HygB平板上连续转接三代，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子若干提基因组，利用引物RoPYC2-F和RoPYC2-R进行PCR验证，得到大小约3.5kb的目的片段，表明RoPYC2基因已成功整合到Y.lipolyticaxa0WSH-Z06基因组中。所得重组菌命名为Y.lipolytica-RoPYC2。该菌在以甘油为唯一碳源的培养基上生长时，胞内丙酮酸羧化酶活性达到0.87U/mgxa0protein，是对照菌株的10.2倍。其中：YPD培养基(g/L)葡萄糖20g，Tryptonexa020g，Yeastxa0extractxa010g，固体培养基添加20g琼脂。YPD+HygB抗性平板(g/L)YPD+200mg潮霉素，固体培养基添加20g琼脂。实施例3甘油为唯一碳源时重组菌与对照菌发酵特性的比较以甘油为唯一碳源，发酵144h后，重组菌和对照菌相比：(1)对照菌中α-酮戊二酸产量为36.3g/L，重组菌中α-酮戊二酸产量可达47.2g/L，是对照菌的1.3倍；(2)对照菌中丙酮酸含量为21.2g/L，而重组菌中丙酮酸含量仅为10.4g/L，丙酮酸积累减少了51％，过量表达RoPYC2基因有效地将碳代谢流从丙酮酸导向中α-酮戊二酸的生成，在提高α-酮戊二酸产量的同时减少了丙酮酸的积累。